鼠疫耶尔森菌

鼠疫耶尔森菌

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌所致的烈性传染病，曾在人类历史上三次大流行，并造成约2亿人死亡，全世界为之战栗。过去几十年鼠疫在全球范围内的流行都已经得到有效的控制，但近年陆续又有一些自然疫源地复燃和新自然疫源地出现，以及可能被生物恐怖分子用作武器，使其仍然是公众健康安全的隐患。因而我们需用分子生物学手段对该疾病重新认识，并在快速诊断和疫苗研制上取得了新的突破，才能从根本上遏制住它的再次大流行，现在利用基因芯片技术对鼠疫菌做进一步的研究仍具有现实意义。

基因芯片技术是上世纪90年代兴起，源于计算机集成化芯片理念的一门新技术。实质就是利用Southernblot原理，以可寻址的方式在载体表面，有序地点阵排列大量DNA双链或Oligo探针。这些被固定在基质的探针上就形成了高密度DNA微阵列。样品DNA或RNA经过荧光标记，与阵列上的探针进行杂交反应，按照碱基互补配对原则，探针特异性地结合相应被荧光标记的分子。用激光激发荧光标记物，就可获得样品分子的信息，从而对基因序列及功能进行大规模、高通量、平行地研究。

鼠疫耶尔森菌含有3个公认与致病性有关的质粒，分别是9.5kb、70kb和110kb，已知的序列提示它们的开放阅读框编码密度很高在70％以上，并且集中了多数已知的鼠疫致病性基因，我们直接利用其限制性片段，采用我们建立的巢式PCR方法进行扩增，制备出供芯片打印的探针，并结合马文丽、郑文岭等建立的限制性显示(RestrictionDisplay，简称为RD)技术标记样品用于鼠疫的检测。通过我们对芯片的杂交条件改进，取消标记样品的纯化过程，提高杂交温度从42℃至52℃和在低严谨洗脱之前先使用蒸馏水冲洗，可有效提高DNA芯片的杂交阳性信号，降低背景和非特异性干扰。提高了检测芯片的信噪比，使其特异性显著提高，获得可信的杂交结果。基因芯片结合RD技术，既快速又能在标记过程中实现样品扩增，发挥基因芯片高度灵敏、准确和简便快速的优点。同时平行检测多个基因，这对鼠疫这种烈性传染病的诊断提供新的科学方法。进行Blast分析，确定出鼠疫菌最为特异的序列，用以设计成60mers的寡核营酸探针。固定探针在用多聚一L一赖氨酸处理过的玻片上，制备成寡核昔酸基因芯片，同样采用RD技术进行样品标记，用以检测。通过我们对杂交条件的改进，能更好的降低非特异性杂交，结果显示，该芯片具有很好的特异性。同时，我们将0119。

芯片用于比较鼠疫活疫苗菌株Ev和分离自我国云南的野生株之间己知毒性基因的表达差异，采用随机引物标记方法，在逆转录合成第一链cDNA过程中，分别掺入cy3/Cys一dCTP，并与芯片杂交，经比较分析，我们发现分离自我国云南的野生株的cafl和caf]R基因有表达下调的趋势，EV株存在卢宕脚基因缺失，在分析结果中，也被验证。

为了确定野生株的‘叨和caflR基因的表达弱于EV株原因，我们将分离自中国云南的两株菌1351和482连同对照的EV株，采用LAPCR将覆盖Cafj操纵子的整个区域扩增，再以Sau3AI不完全消化，制备克隆文库，用3730测序仪测定后，拼接成完整序列，经Blast分析，该段序列在3株菌之间没有差异，与Genebank上的CO92和KIM株的这段序列没有差别，显示这段序列对鼠疫菌是非常保守。

综上所述，基因芯片技术用于鼠疫耶尔森菌研究，不仅为鼠疫的快速诊断提供了新的方法，在其表达谱分析中，也在野生株和EV株之间确定了毒性基因的表达差异。通过对cafl操纵子序列的测定，明确了该段序列的保守性。同时本文的工作对芯片的技术的改进提供了新的手段，进一步拓展了基因芯片在传染性疾病诊断中的应用范围。

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